Как выбрать хроматографическую колонку для анализа тестостерона в сыворотке крови

Анализ тестостерона в сыворотке — один из базовых в лабораторной диагностике мужского здоровья. Его назначают при подозрении на гипогонадизм, контроле заместительной гормональной терапии, при нарушениях либидо и бесплодии. Современные методы определения — это, как правило, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с масс-спектрометрией (МС/MS).

Но чтобы метод дал достоверные результаты, мало просто подключить МС-детектор. Одна из ключевых составляющих — правильная хроматографическая колонка. Вот как её выбрать.

Какие требования к колонке при определении тестостерона

Анализ осложняется несколькими факторами:

• Тестостерон содержится в низких концентрациях — особенно у детей и пожилых мужчин.
• Матрица — сложная: в сыворотке крови есть белки, липиды, жирные кислоты и другие стероиды.
• Аналит ионизируется слабо, особенно без дериватизации.
• Требуется высокая специфичность — чтобы отделить тестостерон от дегидроэпиандростерона, андростендиона и других схожих соединений.

Все эти особенности нужно учитывать при подборе стационарной фазы и геометрии колонки. Подобрать, кстати, можно по ссылке.

Тип стационарной фазы: чаще всего — C18, но не всегда

Для анализа тестостерона чаще всего используют колонки с обратной фазой — C18. Это универсальное решение: подходит под градиентную элюцию, хорошо работает с органическими растворителями, обеспечивает устойчивое удерживание неполярных стероидов.

Но в некоторых случаях C18 не даёт достаточно чёткого разделения. Тогда можно рассмотреть:

• Фенильные фазы — обеспечивают π-π-взаимодействие и улучшают селективность между схожими стероидами.
• C8 — менее гидрофобная фаза, которая иногда даёт лучший отклик при масс-спектрометрии.
• Диольные фазы или с полярной вставкой — подходят для разделения изомеров, но требуют тщательной валидации метода.

HILIC и нормальную фазу используют крайне редко — они хуже справляются с водными матрицами и требуют значительной переработки протокола.

Геометрия колонки: как длина и размер частиц влияют на результат

Типичная колонка для LC-MS/MS-анализа тестостерона:

• Длина: 50–100 мм — короткие колонки уменьшают время анализа и нагрузку на систему.
• Диаметр: 2,1 мм — оптимален для работы с низким расходом элюента.
• Размер частиц: 1,7–2,6 мкм — высокий уровень разделения без чрезмерного давления.
• Материал: уплотнённый сферический силикагель высокой чистоты.

Некоторые лаборатории применяют сверхвысокопроизводительные системы (UHPLC) — в этом случае подойдут колонки с частицами до 1,3 мкм, но только при наличии совместимого оборудования.

Учитываем влияние матрицы: важна устойчивость к загрязнению

Сыворотка крови — агрессивная среда для хроматографических систем. Даже при хорошем препаналитическом этапе остаётся риск:

• Загрязнения колонок липофильными компонентами, особенно при использовании LLE (жидкостно-жидкостной экстракции);
• Адсорбции белков — из-за чего со временем снижается интенсивность сигнала.

Колонка должна быть устойчива к биологическим загрязнителям. Рекомендуется выбирать модели с:

• Эндкаппингом — блокировкой свободных силинольных групп;
• Специальными защитными покрытиями, которые снижают неселективные взаимодействия;
• Совместимостью с высокоорганическими растворителями (например, 100% метанол или ацетонитрил).

Подключение к LC-MS/MS: обратите внимание на фон и хвосты

В МС-аналитике даже незначительный фон от колонки может исказить результат. Поэтому стоит обратить внимание на:

• Стабильность ретенционного времени — особенно при серийном анализе;
• Форму пиков — отсутствие хвостов и сдвоенных сигналов;
• Низкий уровень фонового шума — важен при определении низких концентраций.

Некоторые производители выпускают «low-bleed» колонки — специально для LC-MS/MS. Они дают минимальный вклад в фон и повышают точность анализа.

Когда пора менять колонку и как продлить ей жизнь

Типичные признаки, что колонку пора менять:

• Давление растёт без изменения потока.
• Пик тестостерона становится расплывчатым или смещается.
• Валидационные образцы начинают «проваливаться» по точности.

Чтобы продлить срок службы:

• Промывайте колонку после каждой серии — от высокоорганического к водному.
• Используйте защитные картриджи (guard column).
• Храните колонку в рекомендуемом растворе — часто это смесь органики и воды.

---

Хорошо подобранная колонка — это стабильность, точность и меньше пересдач анализов. Для анализа тестостерона в сыворотке оптимально выбирать:

• Обратную фазу (C18 или фенильную) с частицами до 2 мкм;
• Колонку длиной 50–100 мм и диаметром 2,1 мм;
• Устойчивые материалы с низким фоном;
• Надёжные бренды с проверенными приложениями.

Выбор зависит от лабораторного метода и оборудования — нет универсальной колонки. Но если соблюдать простые принципы и регулярно тестировать стабильность метода, можно добиться точных и воспроизводимых результатов в каждом образце.